Interferenzfaktoren a PCR-Reaktiounen

Wärend der PCR-Reaktioun ginn dacks e puer Stéierungsfaktoren begéint.
Wéinst der ganz héijer Sensibilitéit vun der PCR gëllt Kontaminatioun als ee vun de wichtegste Faktoren, déi d'PCR-Resultater beaflossen, a kann falsch-positiv Resultater verursaachen.
Genauso kritesch sinn déi verschidde Quellen, déi zu falsch-negativen Resultater féieren. Wann een oder méi wesentlech Deeler vum PCR-Mëschung oder der Amplifikatiounsreaktioun selwer inhibéiert oder gestéiert ginn, kann den diagnosteschen Test behënnert ginn. Dëst kann zu enger reduzéierter Effizienz a souguer falsch-negativen Resultater féieren.
Nieft der Inhibitioun kann et zu engem Verloscht vun der Integritéit vun der Zilnukleinsäure wéinst de Transport- an/oder Lagerbedingungen virun der Proufvirbereedung kommen. Besonnesch héich Temperaturen oder eng inadequater Lagerung kënnen zu Schied un Zellen an Nukleinsäuren féieren. Zell- a Gewieffixatioun a Paraffin-Ambetting si bekannt Ursaache fir DNA-Fragmentéierung an e persistent Problem (kuckt d'Figuren 1 an 2). An dëse Fäll hëllefen och eng optimal Isolatioun a Reinigung net.

Figur 1 | Effekt vun der Immobiliséierung op d'Integritéit vun der DNA
D'Agarosegelelektrophorese huet gewisen, datt d'Qualitéit vun der DNA, déi aus Paraffinschnitte vun Autopsien isoléiert gouf, staark variéiert huet. DNA mat ënnerschiddlechen duerchschnëttleche Fragmentlängten war an den Extrakter präsent, ofhängeg vun der Fixatiounsmethod. D'DNA gouf nëmme konservéiert, wann se a nativen agefruerene Proben an a gepuffertem neutralem Formalin fixéiert gouf. D'Benotzung vun engem staark sauerem Bouin-Fixativ oder ongepuffertem, amberesäurehaltege Formalin huet zu engem bedeitende Verloscht vun DNA gefouert. Déi reschtlech Fraktioun ass staark fragmentéiert.
Lénks gëtt d'Längt vun de Fragmenter a Kilobasepaaren (kbp) ausgedréckt.

Figur 2 | Verloscht vun der Integritéit vun Nukleinsäureziler
(a) Eng 3′-5′ Lück op béide Strécke féiert zu engem Broch an der Zil-DNA. D'Synthese vun der DNA wäert ëmmer nach um klenge Fragment stattfannen. Wann awer eng Primer-Annealing-Plaz um DNA-Fragment feelt, geschitt nëmmen eng linear Amplifikatioun. Am gënschtegste Fall kënnen d'Fragmenter sech géigesäiteg nei sättegen, awer d'Ausbeute wäert kleng sinn an ënner dem Detektiounsniveau leien.
(b) De Verloscht vu Basen, haaptsächlech wéinst Depurinatioun an Thymidin-Dimerbildung, féiert zu enger Ofsenkung vun der Zuel vun H-Bindungen an enger Ofsenkung vun Tm. Wärend der verlängerter Erwiermungsphase schmëlzen d'Primer vun der Matrix-DNA of a wäerten net emol ënner manner strenge Konditiounen annealen.
(c) Nopesch Thyminbasen bilden en TT-Dimer.
En anert heefegt Problem, dat dacks an der molekularer Diagnostik optrieden, ass déi manner wéi optimal Fräisetzung vun den Zilnukleinsäuren am Verglach mat der Phenol-Chloroform-Extraktioun. An extremen Fäll kann dëst mat falschen Negativen a Verbindung bruecht ginn. Vill Zäit kann duerch Kachenlysis oder enzymatesch Verdauung vu Zellreschter gespuert ginn, awer dës Method féiert dacks zu enger gerénger PCR-Sensibilitéit wéinst inadequater Nukleinsäurefräisetzung.

Inhibitioun vun der Polymeraseaktivitéit während der Amplifikatioun

Am Allgemengen gëtt Inhibitioun als Containerkonzept benotzt fir all Faktoren ze beschreiwen, déi zu suboptimale PCR-Resultater féieren. Am strikt biochemesche Sënn ass d'Inhibitioun op d'Aktivitéit vum Enzym limitéiert, d.h. si reduzéiert oder verhënnert d'Substrat-Produkt-Konversioun duerch Interaktioun mam aktiven Zentrum vun der DNA-Polymerase oder sengem Cofaktor (z.B. Mg2+ fir Taq DNA-Polymerase).
Komponenten an der Prouf oder verschiddene Puffer an Extrakter, déi Reagenzien enthalen, kënnen den Enzym direkt hemmen oder seng Kofaktoren (z.B. EDTA) afänken, wouduerch d'Polymerase inaktivéiert gëtt an doduerch zu reduzéierten oder falsch-negativen PCR-Resultater féiert.
Vill Interaktiounen tëscht Reaktiounskomponenten an Zil-haltegen Nukleinsäuren ginn awer och als 'PCR-Inhibitoren' bezeechent. Soubal d'Integritéit vun der Zell duerch Isolatioun gestéiert ass an d'Nukleinsäure fräigesat gëtt, kënnen Interaktiounen tëscht der Prouf an hirer ëmleiender Léisung an der fester Phas optrieden. Zum Beispill kënnen 'Scavengers' duerch net-kovalent Interaktiounen eenzel- oder duebelsträngeg DNA bannen an d'Isolatioun an d'Reinigung stéieren, andeems se d'Zuel vun den Ziler reduzéieren, déi schlussendlech de PCR-Reaktiounsbehälter erreechen.
Am Allgemengen sinn PCR-Inhibitoren an de meeschte Kierperflëssegkeeten a Reagenzien präsent, déi fir klinesch diagnostesch Tester benotzt ginn (Harnstoff am Urin, Hämoglobin an Heparin am Blutt), Nahrungsergänzungsmittel (organesch Komponenten, Glykogen, Fett, Ca2+-Ionen) a Komponenten an der Ëmwelt (Phenoler, Schwéiermetaller).

Méi heefeg PCR-Inhibitoren kënnen a Bakterien an eukaryoteschen Zellen, Net-Zil-DNA, DNA-bindende Makromoleküle vu Gewëbematrizen a Laborausrüstung wéi Handschuesch a Plastik fonnt ginn. D'Reinigung vun Nukleinsäuren während oder no der Extraktioun ass déi bevorzugt Method fir PCR-Inhibitoren ze entfernen.
Haut kënnen verschidden automatiséiert Extraktiounsausrüstung vill manuell Protokoller ersetzen, awer eng 100% Erhuelung an/oder Reinigung vun den Ziler gouf nach ni erreecht. Potenziell Inhibitoren kënnen nach ëmmer an de gereinegten Nukleinsäuren präsent sinn oder schonn a Kraaft getrueden sinn. Et gëtt verschidde Strategien fir den Impakt vun den Inhibitoren ze reduzéieren. D'Wiel vun der passender Polymerase kann e wesentlechen Impakt op d'Inhibitoraktivitéit hunn. Aner bewährte Methoden fir d'PCR-Inhibitioun ze reduzéieren sinn d'Erhéijung vun der Polymerasekonzentratioun oder d'Applikatioun vun Zousätz wéi BSA.
D'Inhibitioun vu PCR-Reaktiounen kann duerch d'Benotzung vun interner Prozessqualitéitskontroll (IPC) nogewise ginn.
Et muss drop opgepasst ginn, datt all Reagenzien an aner Léisungen am Extraktiounskit, wéi Ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, Isopropanol a Phenol, duerch e grëndleche Wäschschratt aus dem Nukleinsäureisolat ewechgeholl ginn. Jee no hirer Konzentratioun kënne si d'PCR aktivéieren oder hemmen.