Interferenzfaktoren bei PCR Reaktiounen

Wärend der PCR Reaktioun ginn e puer interferéierend Faktoren dacks begéint.
Wéinst der ganz héijer Empfindlechkeet vu PCR gëtt Kontaminatioun als ee vun de wichtegste Faktoren ugesinn, déi PCR Resultater beaflossen a kënnen falsch positiv Resultater produzéieren.
Gläich kritesch sinn déi verschidde Quellen, déi zu falsch-negativ Resultater féieren. Wann een oder méi wesentlech Deeler vun der PCR-Mëschung oder der Amplifikatiounsreaktioun selwer hemmt oder gestéiert ginn, kann d'diagnostesch Assay behënnert ginn. Dëst kann zu reduzéierter Effizienz a souguer falsch negativ Resultater féieren.
Zousätzlech zu der Hemmung, kann de Verloscht vun der Zil-Nukleinsäure Integritéit optrieden wéinst Versand- an/oder Späicherbedéngungen virun der Probepräparatioun. Besonnesch héich Temperaturen oder inadequater Lagerung kënnen zu Schied un Zellen an Nukleinsäuren féieren. Zell an Tissue Fixatioun an Paraffin Embedding sinn bekannt Ursaachen vun DNA Fragmentatioun an engem persistent Problem (kuckt Figuren 1 an 2). An dëse Fäll hëlleft och eng optimal Isolatioun a Reinigung net.

Figur 1 | Effekt vun Immobiliséierung op DNA Integritéit
Agarose gelies electrophoresis gewisen, datt d'Qualitéit vun der DNA aus paraffin Rubriken vun autopsies isoléiert isoléiert bedeitend variéiert. DNA vu verschiddenen duerchschnëttleche Fragmentlängten war an den Extrakten präsent ofhängeg vun der Fixéierungsmethod. DNA gouf nëmme konservéiert wann se an gebierteg gefruerene Proben fixéiert goufen an a gebufferten neutralen Formalin. D'Benotzung vun engem staark sauer Bouin Fixativ oder ongebufferten, Mieresäure-haltege Formalin huet zu engem bedeitende Verloscht vun DNA gefouert. Déi reschtlech Fraktioun ass héich fragmentéiert.
Op der lénker Säit gëtt d'Längt vun de Fragmenter a Kilobasepaaren (kbp) ausgedréckt.

Figur 2 | Verloscht vun Integritéit vun Nukleinsäure Ziler
(a) Eng 3'-5' Spalt op béide Strécke wäert zu enger Paus an der Zil-DNA féieren. Synthese vun DNA wäert nach op de klenge Fragment geschéien. Wéi och ëmmer, wann e Primer annealing Site am DNA Fragment fehlt, geschitt nëmme linear Amplifikatioun. Am gënschtegsten Fall kënnen d'Fragmenter géigesäiteg resurate, awer d'Ausbezuele wäerte kleng sinn an ënner Detektiounsniveauen.
(b) Verloscht vu Basen, haaptsächlech wéinst der Depurinatioun an der Thymidin-Dimerbildung, féiert zu enger Ofsenkung vun der Unzuel vun H-Bindungen an enger Ofsenkung vun Tm. Wärend der verlängerter Erwiermungsphase schmëlzen d'Primeren vun der Matrix-DNA ewech a ginn net och ënner manner strenge Bedéngungen anneal.
(c) Nopesch Thyminbasen bilden en TT-Dimer.
En anere gemeinsame Problem deen dacks an der molekulare Diagnostik geschitt ass déi manner wéi optimal Verëffentlechung vun Zilnukleinsäuren am Verglach mat Phenol-Chloroform Extraktioun. An extremen Fäll kann dëst mat falschen Negativer verbonne sinn. Vill Zäit ka gespuert ginn duerch kachend Lysis oder enzymatesch Verdauung vun Zellschutt, awer dës Method resultéiert dacks zu enger gerénger PCR Empfindlechkeet wéinst net genuch Nukleinsäure Verëffentlechung.

Inhibitioun vun der Polymerase Aktivitéit während der Amplifikatioun

Allgemeng gëtt Inhibitioun als Containerkonzept benotzt fir all Faktoren ze beschreiwen déi zu suboptimalen PCR Resultater féieren. An engem strikt biochemesche Sënn ass d'Inhibitioun limitéiert op d'Aktivitéit vum Enzym, dh et reduzéiert oder verhënnert d'Substrat-Produkt Konversioun duerch Interaktioun mat der aktiver Säit vun der DNA Polymerase oder sengem Kofaktor (zB Mg2+ fir Taq DNA Polymerase).
Komponenten an der Probe oder verschidde Pufferen an Extrakten, déi Reagenz enthalen, kënnen den Enzym direkt hemmen oder seng Kofaktoren (zB EDTA) falen, doduerch d'Polymerase inaktivéieren an am Tour zu verréngert oder falsch negativ PCR Resultater féieren.
Wéi och ëmmer, vill Interaktiounen tëscht Reaktiounskomponenten an Zil-enthale Nukleinsäuren ginn och als 'PCR-Inhibitoren' bezeechent. Wann d'Integritéit vun der Zell duerch Isolatioun gestéiert gëtt an d'Nukleinsäure fräigelooss gëtt, kënnen Interaktiounen tëscht der Probe a senger Ëmgéigend Léisung a feste Phase optrieden. Zum Beispill, 'Scavengers' kënnen eenzel- oder duebelstrengend DNA duerch net-kovalent Interaktiounen binden a mat Isolatioun a Reinigung stéieren andeems d'Zuel vun Ziler reduzéiert gëtt, déi schlussendlech d'PCR-Reaktiounsschëff erreechen.
Allgemeng sinn PCR-Inhibitoren an de meeschte Kierperflëssegkeeten a Reagenzen präsent fir klinesch diagnostesch Tester (Harnstoff am Pipi, Hämoglobin an Heparin am Blutt), Nahrungsergänzungen (organesch Komponenten, Glykogen, Fett, Ca2+ Ionen) a Komponenten an der Ëmwelt (Phenolen) , Schwéiermetalle)

Méi heefeg PCR-Inhibitoren kënnen a Bakterien an eukaryoteschen Zellen, net-Zil-DNA, DNA-bindende Makromoleküle vun Tissue-Matrixen a Laborausrüstung wéi Handschuesch a Plastik fonnt ginn. Purifikatioun vun Nukleinsäuren wärend oder no der Extraktioun ass déi bevorzugt Method fir PCR Inhibitoren ze läschen.
Haut kënne verschidde automatiséiert Extraktiounsausrüstung vill manuell Protokoller ersetzen, awer 100% Erhuelung an / oder Reinigung vun Ziler gouf ni erreecht. Potenziell Inhibitoren kënnen nach ëmmer an de gereinegten Nukleinsäuren präsent sinn oder hu scho Effekt getraff. Et gi verschidde Strategien fir den Impakt vun Inhibitoren ze reduzéieren. D'Wiel vun der entspriechender Polymerase kann e wesentlechen Impakt op d'Inhibitoraktivitéit hunn. Aner bewährte Methoden fir PCR Hemmung ze reduzéieren sinn d'Erhéijung vun der Polymerase Konzentratioun oder d'Applikatioun vun Additive wéi BSA.
Inhibitioun vun PCR Reaktiounen kann duerch d'Benotzung vun intern Prozess Qualitéitskontroll (IPC) bewisen ginn.
Virsiichteg muss geholl ginn fir all Reagenzen an aner Léisungen am Extraktiounskit, wéi Ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, Isopropanol a Phenol, aus dem Nukleinsäureisolat duerch eng grëndlech Wäschschrëtt ze läschen. Ofhängeg vun hirer Konzentratioun kënne se PCR aktivéieren oder hemmen.